果蠅大腦三維神經網路地圖

精密的大腦地圖，尤其是三維空間大腦地圖的立體模型，對於瞭解腦部的結構及其功能之間的關係，提供有效的研究工具。經由三維模型重建的軟體，可以將一序列的二維生物分子影像重建其立體模型。由於大腦的重要部位有其特殊的結構與功能，因此可以將各部位分別視為單一物件模型，再藉由電腦自動化的程式，我們可以任意組合我們研究需要的關連性模組資料庫。相同的電腦技術，可以應用於任何物件模組化組合的研究領域上。

一、大腦地圖的研究：
人類的大腦擁有神奇的功能，它是個重量約1.4公斤重的器官，內有數億個神經元（neuron）互相連結成數兆個聯結點的神經網路，執行著高度平行運作的能力，可以同時執行多種功能，例如眼睛看東西時，耳朵可同時聽見聲音而鼻子可同時聞到味道。早在1906年Golgi教授和Cajal教授就因為，對於神經系統及神經細胞結構的研究有重大貢獻，獲得了諾貝爾生理醫學獎[1]。但是，直到廿一世紀的今天，我們對於大腦的功能及其神經網路的運作，仍然所知甚少。因此，就如同探險隊對於未知大陸探險時需要地圖一樣，生物醫學界也在積極的開發各種特殊的人體地圖，例如瞭解遺傳疾病的基因組地圖（genome map）等，來探索生物體的機密。而建立精密的大腦地圖（brain map），尤其是三維空間的大腦地圖立體模型，對於瞭解腦部的結構及其功能之間的關係，將會有重大的貢獻，除了可以提供神經科學基礎研究的參考，同時在臨床醫療上也可以協助醫生更清楚掌握患者的腦部狀況。

我們必需依靠我們的大腦來解開人類大腦的祕密。人類是世界上唯一可以經由書面學習，累積知識的記憶，並且有能力藉由過去的經驗，想像未來的生物。我們現在知道大腦和記憶有關，最有力的證據是來自於臨床觀察，許多認知功能失常的研究帶給我們很多線索，讓我們知道聽覺、視覺、語言、行動及記憶等功能，都有大腦特定的部位在掌管。例如，枕葉（occipital lobe）是視覺處理區，頂葉（parietal lobe）掌管動作、方向和物體辦認的功能，顳葉（temporal lobe）與聲音、語言理解及記憶的某些層面有關，額葉（frontal lobe）是大腦功能的匯合區，掌管思考及概念形成與計畫執行，同時也在有意識的情緒表達上扮演著重要的角色。腦幹（brain stem）是身體各部位的神經匯集，經由脊椎進入大腦的通道，它掌管著呼吸、心跳等功能。至於記憶則有短期記憶及長期記憶等不同的類型，例如記住電話號碼的工作記憶（working memory）屬於短期記憶的一種，及深入腦海的兒時情景長期記憶，也由大腦不同的部位控制。小腦（cerebellum）除了負責身體運動協調的平衡之外，也儲存身體反射動作所需的記憶。已知邊緣系統（limbic system）的海馬回（hippocampus）主要負責有意識長期記憶的暫時儲存中繼站[2]。

大腦結構在進行記憶過程時的登錄、儲存及提取的精密過程時，我們無法利用現有的儀器觀察到。現代的生物影像儀器與技術，例如功能性核磁共振影像（functional Magnetic Resonance Imaging, fMRI）與正子放射斷層掃描（Positron Emission Tomography, PET）等顯影技術，顯示出大腦的某些區域在記憶儲存及提取過程中，變得異常活躍起來。雖然大量的實驗影像資料說明了一些現象，但是仍有許多關鍵的問題，尚未有明確的答案，例如大腦神經細胞網路和軸突突觸之間如何連結作用呢？由於上述的大腦功能影像圖片解析度只達到毫米（mm）左右的解析度，無法觀察到微米（mm）尺度的細胞結構。因此為了探索神經網路的作用機制，需要來自簡單的小動物腦部實驗研究，以及解析度更高的生物影像技術來解答問題。

二、小動物的學習與記憶研究：
基於大腦記憶和預測的功能，高等動物可以做出有利於生存和環境適應的選擇。早在廿世紀初期，俄國生理學家巴甫洛夫（Pavlov 1849~1936，1904年諾貝爾生理醫學獎得主）[3]，在鈴聲與餵食的關連性實驗中，證明了狗的心理影響會產生唾液的生理制約反射變化，這種被稱為古典制約的條件反射實驗，是著名的心理與生理行為關連的研究。它提供了如何將兩個事件聯結在一起的最簡單清楚的規則，因此古典制約實驗在研究學習機制的方法中一直佔有重要的地位。

研究大腦功能的動物模型，在目前以分子生物學（molecular biology）為主要的研究工具下，果蠅是最佳的動物模型。原因除了體積小容易飼養，大量繁殖成本低廉之外，它的染色體只有四對，一個世代大約是兩個星期的時間，很快就可以觀察到基因突變的結果。因此果蠅基因體（genomics）研究及基因功能與發生學（development）的關係，是科學界所知最清楚的知識之一。

美國紐約長島冷泉港實驗室（Cold Spring Harbor Laboratory）的Tim Tully博士以果蠅做為實驗材料，承繼了Seymour Benzer傳承下來的實驗方法，發明了果蠅學習機器，證明可以訓練果蠅使其記得聞到的味道，並且可以將味道與其他的事件，如電擊，關聯在一起。

在這個稱為Pavlov’s Flies的實驗中，給果蠅聞第一種味道（odor1），同時給予輕微的電擊使其感覺不舒服；給予第二種味道（odor2），則相安無事。經過一次的學習訓練後立刻給予測試，有90%以上的果蠅會選擇進入第二種味道的空間內趨吉避凶；只有少數的果蠅，會進入第一種味道的空間內。實驗顯示，果蠅會記得與電擊連繫的味道，而避開這個味道。

如果我們將實驗中進入第一種味道的空間內的果蠅收集起來，再進行一次實驗，結果仍然是有90%以上的果蠅會選擇進入第二種味道的空間內；有少數的果蠅，會進入第一種味道的空間內。這似乎可以解釋為，果蠅在集體行動時，可能為了避免全部進入相同的環境中造成集體滅亡，而產生少數個體選擇不同環境的生物安全機制，來保持物種的生命延續。

至於有突變基因的果蠅進行實驗，發現它們會平均分佈於二種味道的空間內，這種隨機分佈的情形，表示它們沒有記住味道與電擊之間的關連性。

果蠅給予密集訓練（massed training），四天後大部份果蠅已經忘掉學習的成果了；如果學習方式改成反覆的間隔訓練（spaced training），有些果蠅記憶可以持續達七天之久，這個時期的果蠅已進入老年期了，表示這些果蠅大腦神經網路有長期記憶的形成[4,5]。反映到人類的學習模式，告訴我們溫故知新的重要性，反覆不斷學習的知識才會陪伴我們一輩子；而臨時抱佛腳開夜車應付考試的東西，很快就會全部還給老師了。

Tully的實驗室利用生物晶片大量分析的能力，找出許多果蠅嗅覺與記憶相關的記憶基因（memory genes）[6]。根據基礎生物化學的研究，Tully博士找到了CREB啟動者（activator）和阻止者（blocker）基因與果蠅的長期記憶有關，活化果蠅的CREB啟動者基因，可以促進長期記憶的形成；而過多的CREB阻止者基因活化會妨礙長期記憶的形成[7,8]。在無脊椎動物的海蛞蝓（Aplysia）實驗中也曾經得到相同的結果[9]，說明了啟動者基因對於長期記憶的重要，及阻止者基因會破壞長期記憶的形成機制。同樣的生化機制若是在哺乳動物也存在的話，我們是否有機會促進人類記憶的形成？許多從果蠅研究得知參與學習與記憶的基因，之後都證實這些基因也同樣參與哺乳類動物的學習及記憶，Tully博士的研究群已經利用老鼠進行了部份實驗，也正在進行藥物的設計及研發[10]。也許有朝一日當我們需要時，一顆〞聰明丸（smart pill）〞可以解決年紀較長的朋友經常忘東忘西的困擾。

三、3D生物模型提供重要的空間資訊
大腦功能的研究可以自微觀分析至巨觀分析分成好幾個層次，基因表現→蛋白質生化反應→神經細胞結構→大腦神經網路形成→動物行為。十九世紀末生理學家的研究，說明了心理影響與行為反應模式之間的邏輯因果關係；二十世紀六十年代開始蓬勃發展的分子生物學，在基因層次操控上，知道基因產物會反應到不同尺度（層次）的生物功能，也就是說，根據生命科學的基礎研究，研究人員可以找出來果蠅嗅覺與記憶相關的記憶基因（memory genes），改變這些基因，可以影響到果蠅的行為表現。雖然在最巨觀的行為表現，及微觀的分子基因表現，科學家都有相當的瞭解。但是在微米級的中觀尺度，神經細胞結構及大腦神經網路形成的三度空間立體結構是否也產生了變化？由於實驗技術的限制，大腦內神經細胞的立體結構不易取得，現在由於結合生物螢光標定及共軛焦顯微鏡光學切片的特性，可以取得大腦組織及其神經網路的高解析度數位影像[11,12]。

結合各種影像的取像技術與電腦科技的計算能力，電腦輔助3D立體影像重建已經有多年的歷史，成為各學科研究人員的最佳電腦輔助工具。然而大部份的模型建立，都是物體表面的3D立體重建，對於生命科學的研究人員而言，我們更有興趣的是生物體內部細節的3D立體重建。

生命科學的研究者對生物體進行研究時的最大希望是在，得到生物體內部結構影像（資訊）的同時，能夠不必破壞到生物體。但是，在取得生物影像的時候，由於實驗設備的物理限制，往往得到的是一序列平面的二維影像，無法立即獲得生物體內器官之間的空間資訊。例如在臨床醫學的應用上，常見到的是醫院裡的醫生們藉由X光電腦斷層掃瞄（computer tomography, CT）、核磁共振造影或正子放射斷層掃描，所得到的一序列的圖片來分析病人的身體狀況，就是我們經常看到一序列的二維平面影像。

為了得到生物體內器官之間的空間資訊，藉由電腦輔助，將一序列的二維平面影像經由電腦軟體的協助，進行3D立體影像的重建（reconstruction），重建後的三維立體模型可以任意旋轉，提供不同的角度觀察我們所要研究的對象，可以幫助我們在電腦螢幕上，從任意角度及方向來觀察生物體的結構。

四、大腦立體模型資料庫
經過二十世紀一整個世紀的努力，人們終於普遍接受了大腦模型可以完全地用模組化（completely modular）來描述。因此對於大腦功能的解釋，也以解剖學的概念依各部位功能進行分析說明。據此，我們可以利用3D立體影像重建技術，建立大腦各重要部位的物件模型，同時依研究的需要，任意組合出要進一步觀察研究的神經叢及神經網路在空間的關係。

在進行3D神經網路資料庫建置時，我們將大腦各部位的神經叢及基因表現的神經網路，視為各別的物件模型，再進行組合。若任意組合，也就是n個物件中取m個做組合，m的數值是自1到n，則組合總數可以高達2的n次方減一的巨量。以果蠅為例，參與大腦功能的基因可能達到八仟個，則組合數是2的8000次方減一（28000-1）的天文數字。讀者立刻可以指出，在大腦研究的生物意義上，並不需要完成所有的組合，但是在藉助影像處理軟體建立模型的執行上，我們必需使這個程序自動化，才能完成大型資料庫建置的工作量，是顯而易見問題。

影像處理軟體在建立3D影像模型時，通常需要使用者與軟體不斷進行對話的互動（interactive）程序來完成，在建置少數模型時還不至於產生困擾，但是在需要建立大量模型時，與軟體頻繁互動的程序便會成為巨大的成本。再加上使用者圖形界面（Graphical User Interface, GUI）的盛行，許多軟體的使用都改成表單式，用滑鼠的點選方式來完成工作。然而為了達成程序自動化的目標，需要選擇適用文字指令的軟體，在此，我選擇可以執行劇本（scripting）程序的影像處理軟體Amira [13]，使用Tcl程式與Amira進行軟硬體的溝通及設定[14]。同時將建立模型的程序標準化，再加上C shell程式，便可以完成由電腦達成3D影像模型資料庫自動化建立程序，同時也可以完成模型三度空間轉動的動畫資料庫。

五、結語
信號經過神經網路在大腦各部位進行傳遞，例如視覺影像先由眼睛的視覺神經細胞接受，再從視網膜經過神經網路送到大腦皮質視覺區域。大腦各種功能運作時信號傳遞所參與的神經迴路，究竟有那些部位的神經叢，神經網路，及蛋白質參與？經由分子生物學的研究，科學家已經發現很多的基因產物參與特定的大腦功能，經由分子螢光標定的技術，我們將可以觀察到這些蛋白質在那些神經網路上的分佈。藉此3D立體模型資料庫我們希望有機會協助神經科學家找到以往未曾發現到的信號傳遞神經迴路，進而協助神經科學研究人員設計實驗，研究大腦複雜的功能。這個自動化電腦組合的程序，同樣適用於解剖學結構的組合，或是其它學科的組合應用。

至於記憶形成時神經網路重整及固化過程的觀察仍待努力。記憶儲存的基本單位是兩個神經細胞之間突觸（synapse）的連結，這已經進入次微米（sub- micrometer）的解析度了，此時神經細胞結構變化的觀察，甚至於生物活體大腦的顯微影像，需要研究工具更加成熟後方能達成，將對研究大腦記憶的形成提供更有力的實驗證據 [15]。

我們深信此一果蠅神經網路立體影像知識庫，以高解析三維影像展示基因表現模式，結合了生物科技、奈米科技及電腦影像科技的技術，在台灣既有的電腦資訊工業及生物科技的基礎上，應有相當好的國際競爭優勢，未來如將已經發展出來的生物顯維影像科技運用於建構小白鼠及人腦神經網路圖譜，其影響將可比擬人類基因體計劃對生命科學研究及生物科技應用的貢獻程度。
作者---謝昌煥博士

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Sciscape新聞[Dec 17, 2006]: 果蠅如何形成長期記憶